Бильярд беляево: Бильярдный клуб Планета на улице Миклухо-Маклая 🍴 отзывы, адрес и как добраться, меню, телефон, онлайн бронирование столиков, цены и фото — Рестораны, бары и кафе — Москва

• За час: 1600 руб 

• Вместимость: 6 человек
• Комнат отдыха: 2
• Аква-зона: Душ, Туалет, Бассейн, Сауна
• Техника: Телевизор, Магнитофон, Кондиционер, Wi-Fi, Караоке
• Развлечения: Бильярд

• За час: 1300 руб 

• Вместимость: 6 человек
• Комнат отдыха: 2
• Аква-зона: Душ, Туалет, Бассейн, Сауна
• Техника: Телевизор, Магнитофон, Кондиционер, Wi-Fi, Караоке
• Развлечения: Бильярд

• За час: 1200 руб 

• Вместимость: 6 человек
• Комнат отдыха: 1
• Аква-зона: Душ, Туалет, Бассейн, Сауна
• Техника: Телевизор, Магнитофон, Кондиционер, Wi-Fi, Караоке
• Развлечения: Бильярд

A Резюрин, неразрушающий анализ для мониторинга пролиферации ячейки во время процесса 3D-культивирования на основе лесов на основе лесов

Абстрактный

Разработка метода оценки жизнеспособных клеток без жертвующих пролиферации и функциями клеток, культивируемых на регенеративных биоматериалах, имеет важное значение для регенеративной инженерии.Цитотоксичность и истощение резазурина являются критическими, но часто упускаемыми из виду ограничениями, которые препятствуют применению резазурина для оценки жизнеспособности клеток. Настоящая работа показала, что цитотоксичность и истощение резазурина зависят от концентрации клеток, концентрации резазурина и времени инкубации резазурина. Для устранения негативных эффектов резазурина была разработана простая стратегия, которая позволяла клеткам инкубировать только с резазурином во время каждого измерения. Эта стратегия была проверена путем мониторинга пролиферации преостеобластов MC3T3-E1 на каркасе из поли(d,l-молочной кислоты) во время непрерывного процесса 3D-культивирования в течение 21 дня, сравнивая точность с анализом МТТ, который представляет собой деструктивный анализ с высокой чувствительностью и точность и обычно используется в регенеративной инженерии и сравнивает функции жизнеспособности, пролиферации и дифференцировки MC3T3-E1, которые были обработаны с использованием этой стратегии или без нее для неразрушающей оценки.Этот метод показал сравнимую линейность стандартной кривой и характеристики кривой роста с анализом МТТ. Никаких серьезных негативных эффектов этого метода на жизнеспособность и функции MC3T3-E1 обнаружено не было. Наша работа подчеркнула важность концентрации и времени инкубации резазурина при разработке неразрушающего анализа жизнеспособности для конкретных приложений и будет полезна для улучшения имплантированных медицинских устройств, а также в регенеративной инженерии.

Ключевые слова: резазурин, неразрушающая оценка жизнеспособности клеток, цитотоксичность, истощение резазурина, регенеративная клеточная медицина моделирование заболеваний [3, 4].Информация о кинетике клеточного роста и жизнеспособности клеток необходима для изучения оптимальных условий культивирования [5], контроля качества процесса регенеративной инженерии [6] и оценки характеристик сконструированных тканей [7, 8]. Обычно жизнеспособные клетки на поверхности или внутри трехмерного каркаса нельзя наблюдать напрямую. Текущие анализы роста и жизнеспособности клеток, обычно используемые в тканевой инженерии, такие как анализ МТТ [9], обнаружение ЛДГ [10], включение [3H]-тимидина [11] и анализ CCK8 [12], являются разрушительными или мешают функциям клеток. и сделать последующий процесс посева или клиническое использование невозможным.Таким образом, разработка неразрушающего количественного анализа для оценки жизнеспособности клеток без ущерба для ценных клеток, полученных от пациентов, и нарушения клеточных функций является насущной необходимостью для процесса 3D-культивирования и регенеративной инженерии.

Резазурин считается красителем с низкой цитотоксичностью и может восстанавливаться жизнеспособными клетками до резоруфина [13]. Прямая корреляция между восстановлением резазурина и количеством жизнеспособных клеток обычно использовалась для оценки активного роста бактерий и клеток [14].Недавно сообщалось об анализе жизнеспособности на основе резазурина как о неразрушающем анализе для мониторинга пролиферации клеток на каркасах или других биоматериалах во время процесса 3D-культивирования [15–17]. В этих исследованиях резазурин инкубировали с клетками в течение всего процесса культивирования. А снижение резазурина использовали для наблюдения за увеличением количества жизнеспособных клеток. Однако в этих исследованиях еще предстоит решить ряд проблем. (i) Хотя резазурин обычно считается низкотоксичным красителем, несколько предыдущих исследований продемонстрировали антипролиферативные и цитотоксические эффекты резазурина в клетках лейкемии и клетках рака яичников [18, 19].Насколько нам известно, в предельных работах внимание уделялось изменениям пролиферации и функций клеток, а также последующему влиянию на строение ткани после воздействия резазурина, все из которых являются очень важными факторами, которые следует учитывать при разработке неразрушающего метода оценки жизнеспособности клеток во время исследования. процесс построения тканей. (ii) Высокая концентрация клеток и длительное время инкубации могут привести к истощению пула резазурина и потере точной корреляции между снижением уровня резазурина и количеством жизнеспособных клеток, что является важным ограничением, которое часто упускают из виду.(iii) Резоруфин может быть дополнительно восстановлен живыми клетками до гидрорезоруфина, который является бесцветным и нефлуоресцентным [20]. Этот второй окислительно-восстановительный этап может привести к аберрантным результатам: система с высокой концентрацией клеток дала слабый сигнал, а система с низкой концентрацией клеток дала высокий сигнал, особенно при длительном времени инкубации резазурина. Насколько нам известно, ограниченная работа оценивает влияние концентрации клеток и времени инкубации резазурина на жизнеспособность клеток, функцию клеток и точность анализа пролиферации на основе резазурина, все из которых имеют решающее значение для процесса 3D-культивирования.

В этом исследовании мы исследовали изменения жизнеспособности и функций клеток после воздействия резазурина, которые являются очень важными факторами, которые необходимо учитывать при разработке неразрушающего метода оценки жизнеспособности клеток в процессе построения ткани. Основываясь на этих исследованиях, мы поделились ценной информацией, не представленной в других источниках, и предложили простую и эффективную стратегию на основе резазурина для более точного мониторинга жизнеспособности и роста клеток без ущерба для жизнеспособности и функций клеток в процессе трехмерного культивирования продолжительностью до 21 дня.

Материалы и методы

Изготовление каркасов

Каркасы были изготовлены из поли(d,l-молочной кислоты) (PLA, молекулярная масса 400 кДа, Dikang Biomedical, Чэнду, Китай) с использованием метода выщелачивания порообразователя. Вкратце, растворы PLA/тетрагидрофурана смешивали с хлоридом калия (KCl) диаметром 450–630 нм для получения пористости 93,74 ± 0,42% (объемная доля) и сушили в стеклянной форме диаметром 16 мм при комнатной температуре. Каркасы (диаметром 16 мм, толщиной 2 мм) покрывали раствором желатина с концентрацией 1 мг/мл на 10 ч и сшивали 0.25% раствор глутарового альдегида на ночь. Затем матриксы промывали ddH ₂ O в течение 2 сут (замена каждые 6 ч) и сушили в лиофилизаторе. Каркасы дезинфицировали погружением в 75% этанол на 4 часа и шесть раз промывали стерильным PBS. Затем каждый каркас (дополнительный рис. S1) был разрезан на четыре сектора одинакового размера. Эти сектора использовались в качестве каркасов в следующих экспериментах.

Культура клеток

Клеточная линия преостеобласта MC3T3-E1 была приобретена у ATCC (Манассас, Вирджиния, США).Исходные клетки культивировали в минимальной основной среде Alpha (α-MEM, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco, США) и 1% пенициллина/стрептомицина (Sangon, Шанхай, Китай). Эндотелиальные клетки аорты крысы (RAEC) [21], эндотелиальные клетки-предшественники костного мозга крысы (EPCs) [22], мезенхимальные стволовые клетки костного мозга крысы (MSC) [23] и эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) [24]. ] были выделены и культивированы в соответствии с нашими предыдущими исследованиями.RAEC культивировали в среде M199 (Gibco, Langley, OK, USA), содержащей 20% FBS, 1% пенициллин/стрептомицин и 50 мкг/мл гепарина (Ameresco, Solon, OH, USA). EPC культивировали в среде M199, содержащей 10% FBS, 50% среду для эндотелиальных клеток (Sciencell, Карлсбад, Калифорния, США), 1% пенициллин/стрептомицин и 50 ЕД/мл гепарина. МСК культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы (Gibco, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. HUVEC культивировали в среде эндотелиальных клеток с добавлением 10% FBS.Клетки культивировали в клеточном инкубаторе при 37°C с 5% CO ₂ и пассировали обычным образом. Питательные среды меняли каждые 3 дня. Клетки трипсинизировали после субконфлюэнтности и подсчитывали с помощью окрашивания трипановым синим. Аликвоты клеточных суспензий объемом 40 мкл (5 × 10 ⁵ клеток/мл) пипетировали на каркасы. Каждый каркас был засеян 2 × 10 ⁴ клеток. Каркасы с засеянными клетками культивировали в 6-луночном планшете в течение 24 часов, обеспечивая прилипание клеток, а затем инкубировали в 24-луночных планшетах с 1 мл культуральной среды на лунку.

Анализ МТТ

Каркасы два раза промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем инкубировали в 1 мл свежей среды, содержащей 20 мкл МТТ [3-(4,5-диметилдиазол-2-ил)-2,5- бромид дифенилтетразолия; Sigma, Сент-Луис, Миссури, США, 5 мг/мл] растворы на 4 часа. Среду удаляли и добавляли 400 мкл 0,1 М HCl/10% раствора додецилсульфата натрия (ДСН). Оптическую плотность (ОП) образца измеряли при 490 нм с помощью Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, США).Жизнеспособные клетки на каркасах количественно определяли с использованием стандартной кривой, которую проводили в каждый момент времени. Все эксперименты проводились в четырехкратной повторности.

Оценка цитотоксического действия концентрации резазурина и времени инкубации

Клетки MC3T3-E1 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2 × 10 ⁴ клеток/лунку и культивировали в течение 24 часов. Затем клетки инкубировали в средах, содержащих 2,0, 1,0, 0,4, 0,2 и 0,1 мМ резазурина соответственно (100 мкл/лунку).Через 1, 2, 4, 8 и 24 ч инкубации среды с резазурином удаляли. Клетки трижды промывали PBS и культивировали в свежей культуральной среде в течение 48 часов. Затем измеряли жизнеспособность клеток с помощью МТТ-анализа и нормализовали относительно жизнеспособности контрольных клеток, которые инкубировали в свежей культуральной среде. Каждое условие было протестировано в четырехкратной повторности.

Оценка влияния времени инкубации резазурина на оценку жизнеспособности клеток

Клетки MC3T3-E1 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 100, 50, 25, 12.5, 6,25, 3,12 и 1,56 × 10 ⁴ клеток/лунку с использованием метода двойного разведения и культивирования в течение 24 часов. Затем клетки инкубировали в свежей среде, содержащей 0,2 мМ резазурина (100 мкл/лунку). Снижение поглощения при 605 нм измеряли путем считывания поглощения образца на Varioskan Flash в моменты времени 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36 и 96 часов. Изменение окраски сред контролировали по фотографии через те же промежутки времени. Каждое условие было протестировано в четырехкратной повторности. В качестве контроля использовали лунки, не содержащие клеток.

Оценка остаточного резазурина на каркасе с засеянными клетками после промывки PBS

Четыре каркаса засевали клетками MC3T3-E1 с плотностью 2 × 10 ⁴ клеток/каркас и культивировали в 24-луночных планшетах. Питательные среды меняли каждые 3 дня. Через 7 дней культивирования каркасы инкубировали в среде, содержащей 0,2 мМ резазурина, в течение 1 часа. Затем резазурин удаляли и каркасы дважды промывали PBS. Через 0 и 1 ч после добавления резазурина, а также сразу после промывки PBS изменение цвета матриксов отслеживали по фотографии.Затем скаффолды инкубировали в свежих средах. Через временные интервалы 0, 1, 2 и 4 часа высвобождение остаточного резазурина определяли путем измерения поглощения при 605 нм с использованием Varioskan Flash. Незасеянные клетки использовали в качестве контроля.

Количественный мониторинг жизнеспособности клеток и клеточного роста в процессе культивирования

Клетки MC3T3-E1 высевали на каркасы PLA при плотности 2 × 10 ⁴ клеток/каркас и культивировали в 24-луночных планшетах. Во время культивирования жизнеспособность клеток и рост клеток измеряли через 1, 4, 7, 10, 14, 18 и 21 день с использованием анализа резазурина.Вкратце, каркас инкубировали со свежей средой, содержащей 0,2 мМ резазурина, в клеточном инкубаторе в течение 1 часа. Через 0 и 1 ч после добавления резазурина аликвоту 100 мкл раствора образца переносили в новый 96-луночный планшет и анализировали снижение поглощения при 605 нм путем считывания поглощения образца на Varioskan Flash. Жизнеспособные клетки на каркасах количественно определяли с использованием стандартной кривой, которую проводили в каждый момент времени. После этого каркас два раза промывали стерильным PBS для удаления резазурина, а затем культивировали в свежей среде в клеточном инкубаторе до следующего времени измерения.Контрольную группу не обрабатывали резазурином и культивировали, меняя только среду каждые 3 дня. Жизнеспособность и пролиферацию контрольной группы измеряли с помощью анализа МТТ в том же интервале. Для проведения измерения как резазурина, так и МТТ в каждый момент времени использовали четыре каркаса с засеянными клетками.

РАЭК высевали на нановолокнистый каркас из сульфатированного фиброина шелка, приготовленный в соответствии с нашей предыдущей работой [21] с плотностью 2 × 10 ⁴ клеток/каркас.МСК и HUVEC высевали в 24-луночные планшеты при плотности клеток 2 × 10 ⁴ клеток/лунку соответственно. ЭПК высевали в 24-луночные планшеты с плотностью клеток 1 × 10 ⁴ клеток/лунку. Все образцы культивировали в 24-луночных планшетах. Во время культивирования жизнеспособность клеток и рост клеток измеряли через 1, 3, 5 и 7 дней с использованием анализа резазурина, как указано выше. Контрольную группу не обрабатывали резазурином и культивировали, меняя только среду каждые 3 дня. Жизнеспособность и пролиферацию контрольной группы измеряли с помощью анализа МТТ в том же интервале.

Анализ жизнеспособности живых/мертвых клеток

Жизнеспособность клеток, культивируемых на каркасе, определяли окрашиванием живых/мертвых клеток на 7, 14 и 21 день инкубации. Рабочий раствор живого/мертвого красителя готовили путем добавления 10 мкл маточного раствора диацетата флуоресцеина (5 мг/мл, Sangon) и 10 мкл исходного раствора йодида пропидия (2,5 мг/мл, Sangon) к 10 мкл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS). ) [21, 25]. Каркас два раза промывали стерильным HBSS и инкубировали в 500 мкл рабочего раствора живого/мертвого красителя при 37°С в течение 20 мин.Затем каркас дважды промывали HBSS и исследовали под флуоресцентной микроскопией (Leica DM IRB, Германия). Жизнеспособные клетки флуоресцируют ярко-зеленым, тогда как мертвые клетки флуоресцируют красным из-за поглощения йодида пропидия.

Экстракция РНК и количественная ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК клеток MC3T3-E1 выделяли на 7, 14 и 21 день 3D-культивирования. В каждый момент времени три каркаса объединяли в один образец. Каркасы осторожно промывали PBS, чтобы смыть остатки среды.Тризольный реагент (Tiangen Biotech, Пекин, Китай) добавляли непосредственно на каркасы и осторожно перемешивали на шейкере в течение 20 мин. Лизат вместе с каркасами собирали в пробирку Эппендорфа с последующим встряхиванием и центрифугированием. Прозрачный клеточный лизат переносили в новую пробирку Эппендорфа, свободную от РНКазы. Затем проводили выделение тотальной РНК в соответствии с протоколом производителя набора RNAsimple total RNA (Tiangen Biotech). Экспрессию генов костного сиалопротеина (BSP), коллагена I типа (COL I) и остеокальцина (OCN) анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени.кДНК первой цепи синтезировали из 1 мкг тотальной РНК с использованием ReverTra Ace (TOYOBO, Осака, Япония). Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием RNA-direct SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO) в приборе Opticon PCR (MJ Research, США) ( n  = 3, всего = девять каркасов, три каркаса были объединены) . Условия амплификации кДНК составляли 60 с при 95°C и 5 с при 95°C, за которыми следовали 39 циклов по 15 с при 59°C и 30 с при 72°C, со сбором данных за последние 30 с. Относительную экспрессию мРНК нормализовали относительно экспрессии GAPDH с использованием метода 2 ^-ΔΔCq [26].Последовательности праймеров перечислены в .

Таблица 1

Партнерские последовательности, используемые для количественной реального времени ПЦР

Активность щелочной фосфатазы

На 4, 7, 10, 14, 18 и 21 день инкубации клетки, культивированные на каркасе, дважды промывали PBS, после чего d тремя циклами замораживания и оттаивания.Каркасы несколько раз пипетировали для обеспечения лизиса клеток. Затем определяли активность щелочной фосфатазы (ЩФ) с помощью анализа p -нитрофенилфосфата (pNPP, Sigma) [16]. Раствор pNPP был приготовлен в соответствии с работой Sun. Аликвоты 50 мкл клеточного лизата добавляли в 50 мкл раствора pNPP (1 мг/мл) и смесь инкубировали при 37°С в течение 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 25 мкл 3 М NaOH на 100 мкл реакционной смеси. Активность ALP определяли количественно путем измерения поглощения при 405 нм.Общее содержание белка определяли с использованием набора для анализа BCA (Cwbio, Пекин, Китай) в аликвотах тех же образцов. Уровни ЩФ нормировали по содержанию общего белка в конце эксперимента.

Содержание кальция

На 4, 7, 10, 14, 18 и 21 день инкубации определяли содержание кальция в матриксе методом ортокрезольфталеинового комплексона (OCPC). Матрицы трижды промывали PBS, погружали в 0,5 мл 0,5 М раствора уксусной кислоты и инкубировали в течение ночи.Затем каркасы несколько раз пипетировали, чтобы обеспечить высвобождение кальция. Аликвоты 10 мкл раствора из лунки добавляли к 300 мкл раствора OCPC и смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем измеряли поглощение при 575 нм с помощью Varioskan Flash. Раствор OCPC был приготовлен согласно работе ван ден Долдера [27].

Измерение NO

На 3, 5 и 7-й день инкубации собирали культуральную среду РАЭК. Уровни NO определяли в соответствии с инструкциями производителя коммерческого набора для анализа общего NO (Институт биотехнологии Beyotime, Китай), основанного на модифицированной реакции Грисса, и анализировали путем измерения поглощения при 540 нм.Продуктивность NO была получена нормированием продукции NO каждого образца на время инкубации соответствующих культуральных сред.

Статистический анализ

Каждый эксперимент независимо повторяли не менее 3 раз. Все данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение ( n  = 3). Статистический анализ проводили с использованием непарного двустороннего критерия Стьюдента t . Значение P  < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Концентрация резазурина и время инкубации влияют на жизнеспособность клеток MC3T3-E1

Влияние концентрации резазурина и времени инкубации на жизнеспособность клеток MC3T3-E1 оценивали с использованием анализа МТТ ().Не наблюдалось явного снижения жизнеспособности через 1 ч воздействия во всех группах, инкубированных с резазурином, по сравнению с контрольной группой (0 мМ резазурина). Значительное снижение жизнеспособности наблюдалось с увеличением времени инкубации (группа 2,0 мМ через 2 часа, группа 1,0 мМ через 4 часа, группы 0,4 и 0,2 мМ через 8 часов и 0,1 мМ через 24 часа, P  < 0,05), что указывает на то, что как концентрация резазурина, так и время инкубации влияют на жизнеспособность клеток MC3T3-E1. Более того, через 24, 36 и 48 часов инкубации с 0.1 мМ резазурина жизнеспособность клеток снизилась до 80,87 ± 2,49%, 71,79 ± 2,46% и 43,45 ± 4,54% от контрольной группы соответственно (дополнительный рисунок S2), что указывает на повреждение клеток в результате длительной инкубации резазурина. Поскольку жизнеспособность клеток очень важна для работы клеточных регенеративных тканевых имплантатов, следует избегать длительной инкубации с резазурином, даже при низких концентрациях.

Цитотоксичность концентрации резазурина и времени инкубации в отношении клеток MC3T3-E1.* Достоверная разница между тестовой группой и контрольной группой при P  < 0,05. ** Достоверная разница между тестовой группой и контрольной группой при P  < 0,01

Длительная инкубация с резазурином влияет на оценку жизнеспособности клеток за счет цитотоксических эффектов и истощения запасов резазурина

При инкубации клеток с 0,1, 0,2 или 0,4 мМ резазурина в течение 4 часов (). Мы также обнаружили, что MC3T3-E1 демонстрировали лучшую линейность восстановления резазурина в широком диапазоне концентраций клеток и длительное время реакции, когда их инкубировали с 0.2 мМ резазурина, чем при инкубации с 0,1 мМ резазурина (и дополнительный рисунок S3). Аналогичные результаты были получены от RAEC, EPC, MSC и HUVEC (данные не показаны). Поэтому мы использовали 0,2 мМ резазурина для оценки жизнеспособности клеток.

Влияние концентрации клеток и времени инкубации резазурина на оценку жизнеспособности клеток. ( A ) График изменения цвета резазурина в разные моменты времени. ( B – D) Снижение абсорбции резазурина в зависимости от концентрации жизнеспособных клеток MC3T3-E1 и времени инкубации.(B) Концентрация клеток колебалась от 0 до 100 × 10 ⁴ клеток/лунка, (C) концентрация клеток колебалась от 6,25 до 100 × 10 ⁴ клеток/лунка и (D) концентрация клеток колебалась от 1,56 до 6,25 × 10 ⁴ клеток/лунку

Мы оценили влияние концентрации клеток и периода инкубации на оценку жизнеспособности клеток (). На ранней стадии инкубации изменение поглощения при 605 нм, по-видимому, увеличивалось линейно с увеличением времени инкубации.Линейность была хорошей в течение 4 часов при высокой плотности клеток (6,25–100 × 10 ⁴ клеток/лунку) и в течение 24 часов при низкой плотности клеток (1,88–3,12 × 10 ⁴ клеток/лунка, ). Затем скорость изменения поглощения при 605 нм замедлялась до тех пор, пока не наблюдалось явных изменений после 24 ч инкубации во всех группах концентрации клеток (). Примечательно, что для плотности клеток от 25 до 100 × 10 ⁴ клеток/лунку розовый цвет среды явно не изменился через 12 часов инкубации, что указывает на истощение резазурина ().Для плотности клеток в диапазоне от 1,88 до 3,12 × 10 ⁴ клеток/лунку пурпурный цвет среды явно не изменился после 24 ч инкубации, что указывает на то, что в лунке осталось достаточно резазурина (). В сочетании с результатами, упомянутыми выше (), снижение скорости восстановления резазурина в группе с низкой концентрацией клеток было связано с цитотоксичностью длительного инкубирования резазурина. Таким образом, длительное воздействие резазурина приводит к цитотоксичности по отношению к клеткам MC3T3-E1 и истощению запасов резазурина, что может способствовать невозможности непрерывной оценки жизнеспособности клеток.

Добавление и удаление резазурина не влияли на жизнеспособность клеток

Мы разработали новую стратегию количественного определения жизнеспособных клеток на основе резазурина, чтобы избежать отрицательных эффектов, вызванных высокой концентрацией и длительным временем инкубации резазурина (). Резазурин добавляли в культуральную систему непосредственно перед измерением и инкубировали с жизнеспособными клетками в течение 1 часа. Затем измеряли уменьшение поглощения при 605 нм. Резазурин и его продукт, резоруфин, удаляли промывкой PBS сразу после измерения.Клетки культивировали в свежей среде до следующего измерения.

Схематическая диаграмма нашей стратегии непрерывного измерения жизнеспособных клеток, основанная на настоящем исследовании

Оценивалась возможность удаления резазурина и его продукта с пористого каркаса. Через 0 ч после добавления резазурина как пустой каркас, так и каркас с засеянными клетками были синими. Через 1 час после добавления резазурина пустой каркас все еще был синим, в то время как каркас с засеянными клетками был розовым, что указывало на то, что жизнеспособные клетки восстанавливали резазурин до резоруфина.После промывания PBS как пустой каркас, так и каркас с засеянными клетками становились белыми, что указывало на удаление резазурина и резоруфина (2). После промывки PBS в течение 0, 1, 2 и 4 ч поглощение при 605 нм среды, инкубированной с контрольным материалом или каркасом с засеянными клетками, было почти равно нулю и почти одинаково (), что свидетельствует о том, что резазурин не высвобождается из каркаса с засеянными клетками. после промывания PBS. Более того, жизнеспособные клетки на обработанном резазурином каркасе и необработанном каркасе определяли визуально путем окрашивания живых/мертвых клеток.Между этими двумя группами не наблюдалось существенной разницы с точки зрения жизнеспособности клеток (). Эти результаты показали, что резазурин и резоруфин могут быть легко удалены с каркаса путем промывания PBS, и этот процесс не влияет на жизнеспособность клеток MC3T3-E1.

Добавление и удаление резазурина не влияли на жизнеспособность MC3T3-E1, культивируемых на каркасах 3D PLA. Изменения цвета пустого каркаса ( A ) и каркаса с засеянными клетками, которые инкубировались в течение 7 дней ( B ) после 0 и 1 ч добавления резазурина и сразу после промывки PBS (слева направо).( C ) Оценка остаточного резазурина на бланке и каркасе с засеянными клетками после промывания PBS путем измерения поглощения при 605 нм. Каждая точка представляла собой среднее значение показателей поглощения четырех каркасов. ( D и E ) Изображения эффектов добавления и удаления резазурина на жизнеспособность клеток, оцененные путем окрашивания живых (зеленый)/мертвых (красный). (D) контрольная группа и (E) группа, инкубированная с резазурином. Масштабная линейка: 100  мкм

Влияние повторного измерения жизнеспособных клеток на жизнеспособность клеток и рост клеток

Затем мы оценили влияние повторной оценки жизнеспособных клеток нашей стратегии, которая требует многократного добавления и удаления резазурина в процессе 3D-культивирования, на клетки жизнеспособность и рост клеток.Жизнеспособные клетки на матриксе определяли методом резазурина на 1, 3, 7, 10, 14, 18 и 21 сут инкубации. Резазурин добавляли в культуральную систему непосредственно перед измерением и удаляли сразу после завершения измерения. Между измерениями каркасы с засеянными клетками культивировали на свежих средах. Жизнеспособные клетки на контрольных каркасах измеряли с помощью анализа МТТ. Резазурин и метод МТТ показали сравнимую линейность стандартной кривой (). Кривая роста, полученная с помощью анализа резазурина, показала характеристики, сходные с кривыми, полученными с помощью анализа МТТ.После 24-часовой лаг-фазы клетки росли экспоненциально со 2-го по 7-й день, а затем количество жизнеспособных клеток медленно увеличивалось. На 21-й день инкубации количество жизнеспособных клеток на каркасе достигло 85 × 10 ⁴ клеток (). Через 7, 14 и 21 день инкубации жизнеспособность и пролиферацию клеток определяли визуально путем окрашивания живых/мертвых клеток (1). Плотность жизнеспособных клеток увеличивалась с увеличением времени культивирования. Плотность жизнеспособных клеток на 21-й день в обеих группах была намного выше, чем на 7-й и 14-й день.Мертвых клеток почти не наблюдалось. Между группой, инкубированной с резазурином, и контрольной группой не наблюдалось существенной разницы в отношении жизнеспособности клеток и клеточной пролиферации. Эти результаты показали, что анализ резазурина был сравним с анализом МТТ по чувствительности и надежности, а повторное добавление и удаление резазурина не влияло на жизнеспособность и рост клеток.

Влияние повторной оценки жизнеспособности клеток на жизнеспособность и рост MC3T3-E1, культивируемых на каркасах 3D PLA.( A – F ) Репрезентативные изображения жизнеспособных клеток, которые были культивированы на каркасе 3D PLA и определены путем окрашивания живых (зеленый)/мертвых (красный). (A–C) Жизнеспособные клетки контрольной группы. (D–F) Жизнеспособные клетки тестовой группы, которые неоднократно контролировались анализом резазурина. Масштабная линейка: 100  мкм. ( G ) Кривые роста клеток MC3T3-E1, которые культивировали на каркасе 3D PLA. За контрольной группой и контрольной группой следили с помощью анализа МТТ и анализа резазурина соответственно.Каждая точка представляла собой среднее значение показателей поглощения четырех каркасов. Репрезентативные стандартные кривые анализа резазурина ( H ) и анализа МТТ ( I )

Влияние повторного измерения жизнеспособных клеток на экспрессию генов трех маркерных генов, BSP, COL I и OCN, на 7, 14 и 21 день инкубации анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Экспрессия всех генов увеличивалась со временем культивирования (1).Хотя экспрессия гена в группе, инкубированной с резазурином, на 21-й день была немного меньше, чем в контрольной группе, результат статистического анализа не показал существенной разницы в экспрессии BSP (

Влияние повторного измерения жизнеспособности клеток на экспрессию генов в клетках MC3T3-E1, культивируемых на каркасах 3D PLA. Экспрессию генов BSP ( A ), COL I ( B ) и OCN ( C ) анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. В качестве образцов использовали клетки, выращенные на матриксах опытной и контрольной групп в течение 7, 14 и 21 сут.Ось у представляет кратность изменений экспрессии генов, нормализованную GAPDH. Каждые данные представляли собой среднее значение трех образцов, и три каркаса были объединены в образец ( n  = 3, всего = девять каркасов для одних данных)

Влияние повторного измерения жизнеспособных клеток на отложение кальция

повторная оценка жизнеспособности клеток по активности ALP и отложению кальция, которые являются важными функциями остеобластов. И активность ALP, и отложения кальция увеличиваются с увеличением времени культивирования (1).Нет существенных различий в активности ALP ( p = 0,069 в день 4, p = 0,207 в день 7, p = 0,923 в день 10, p = 0,989 в день 14, p = 0,841 в день 18 и P = 0,393 P = 0.393 в день 21) и депозит кальция ( P = 0,719 в день 4, P = 0,442 в день 7, P = 0,527 в день 10, г = 0,980 в день 14 , P  = 0,978 на 18-й день и P  = 0,741 на 21-й день) по результатам статистического анализа, хотя как активность ЩФ, так и отложение кальция в опытной группе на 21-й день были несколько меньше, чем у контрольной группы. контрольная группа, которая показала, что многократное добавление и удаление резазурина не оказывало существенного влияния на функцию депонирования кальция.

Влияние повторного измерения жизнеспособности клеток на активность ALP и содержание кальция в клетках MC3T3-E1, культивируемых на каркасах 3D PLA. ( A ) Активность ALP в опытной группе и контрольной группе, культивируемых в течение 4, 7, 10, 14, 18 и 21 дней. ( B ) Содержание кальция в опытной группе и контрольной группе, культивируемых в течение 4, 7, 10, 14, 18 и 21 дня. Каждые данные представляли собой среднее значение четырех каркасов

Применение недавно разработанного метода к другим типам клеток

Чтобы продемонстрировать универсальность недавно разработанного метода, упомянутый выше анализ резазурина был адаптирован для мониторинга роста RAEC в течение 7-дневного непрерывного культивирования. не повреждая клетки.РАЭК культивировали на нановолоконном каркасе из сульфатированного фиброина шелка. Рост клеток контролировали через 1, 3, 5 и 7 дней инкубации с использованием анализа резазурина, как указано выше. Подобно результатам, полученным на MC3T3-E1, между группой, инкубированной с резазурином, и группой, инкубированной с резазурином, не наблюдалось существенных различий в отношении жизнеспособности (), пролиферации () и продукции NO (), которая является важным показателем гемостатической функции RAEC. контрольная группа.

Влияние повторной оценки жизнеспособности клеток на жизнеспособность, рост и гемостатическую функцию РАЭК, культивируемых на нанофиброзном каркасе из сульфатированного фиброина шелка.( A–H ) Репрезентативные изображения жизнеспособных клеток, которые были культивированы на нановолоконном каркасе из сульфатированного фиброина шелка и определены путем окрашивания живых (зеленый) / мертвых (красный). (A–D) Жизнеспособные клетки контрольной группы. (E–H) Жизнеспособные клетки опытной группы, которые неоднократно контролировались с помощью анализа резазурина. Масштабная линейка: 200  мкм. ( I ) Кривые роста RAEC, которые были культивированы на нановолоконном каркасе из сульфатированного фиброина шелка. За контрольной группой и контрольной группой следили с помощью анализа МТТ и анализа резазурина соответственно.Репрезентативные стандартные кривые анализа резазурина ( J ) и анализа МТТ ( K ). ( L ) Продуктивность NO опытной группы и контрольной группы при культивировании на 3, 5 и 7 сутки. Каждые данные представляли собой среднее значение четырех каркасов

Другие три вида клеток, EPC, MSC и HUVEC, с различными внутренними профилями метаболической активности и применениями, были адаптированы для оценки универсальности недавно разработанного метода в качестве неразрушающего анализа для непрерывного процесса культивирования далее.Метод резазурина и МТТ показали сравнимую линейность стандартной кривой. Кривая роста этих клеток, полученная с помощью анализа резазурина, показала характеристики, сходные с кривыми, полученными с помощью анализа МТТ ().

Влияние повторной оценки жизнеспособности клеток на рост EPC, MSC и HUVEC, культивируемых на 24-луночном планшете. Кривые роста EPC ( A ), MSC ( D ) и HUVEC ( G ), которые культивировали в 24-луночном планшете. За контрольной группой и контрольной группой следили с помощью анализа МТТ и анализа резазурина соответственно.Каждая точка представляла собой среднее значение показателей поглощения четырех каркасов. Репрезентативные стандартные кривые анализа резазурина EPC ( B ), MSC ( E ) и HUVEC ( H ). Репрезентативные стандартные кривые анализа МТТ EPC ( C ), MSC ( F ) и HUVEC ( I )

Обсуждение

важно для оптимизации условий 3D-культивирования и контроля качества клеточной регенеративной медицины [17, 20].Это давало преимущества сохранения клеток в культуре для наблюдения за изменениями с течением времени и позволяло проводить дальнейшие исследования или приложения на том же образце. Резазурин считается хорошим репортерным красителем для измерения жизнеспособности клеток [13, 14]. Однако цитотоксичность, истощение резазурина и второй окислительно-восстановительный этап, вызванный высокой концентрацией резазурина и длительным временем инкубации, являются критическими, но часто упускаемыми из виду ограничениями, которые препятствуют его применению для неразрушающего контроля жизнеспособности клеток и мониторинга пролиферации клеток.В настоящем исследовании изучалось влияние концентрации и времени инкубации резазурина на жизнеспособность и функции MC3T3-E1 с различной плотностью клеток и был представлен анализ на основе резазурина для количественного мониторинга роста клеток без потери клеток или нарушения функции клеток во время процесса 3D-культивирования.

Преостеобласт MC3T3-E1 был использован для исследования в этом исследовании. Остеобластическая дифференцировка MC3T3-E1 обычно требует 90–65 недель in vitro 90–666. Оценка жизнеспособности клеток с помощью нашей стратегии может проводиться много раз в течение длительного времени культивирования.Например, в этом исследовании жизнеспособные клетки измеряли семь раз в течение непрерывного культивирования до 21 дня. Таким образом, это хорошая модель для проверки эффективности и безопасности нашей стратегии путем сравнения точности с анализом МТТ и оценки влияния повторного добавления и удаления резазурина на пролиферацию и функцию клеток.

Настоящее исследование показало, что длительное воздействие резазурина приводит к цитотоксичности по отношению к клеткам MC3T3-E1 и истощению запасов резазурина. Наши данные были подтверждены отчетом Эрикштейна о том, что пролиферация клеток HL-60 была значительно снижена через 6 часов даже при самой низкой концентрации резазурина (22 мМ).Они также обнаружили ослабляющее действие резазурина на пролиферацию нескольких первичных бластов ОМЛ, выделенных от больных [18]. Принято считать, что резазурин является малотоксичным красителем [13, 17, 20]. Однако важно отметить, что резазурин малотоксичен, не нетоксичен для клеток. Настоящее исследование показало, что цитотоксичность резазурина зависит от его концентрации и времени инкубации с клетками. Цитотоксичность резазурина может не иметь большого влияния на измерение количества жизнеспособных клеток при длительной инкубации, если в тех же условиях была проведена стандартная кривая для выявления взаимосвязи между изменением поглощения (или интенсивности флуоресценции) и количеством клеток и исключить систематические ошибки, вызванные цитотоксичностью и вторичным окислительно-восстановительным потенциалом резазурина.Однако цитотоксичность резазурина наносит вред жизнеспособности и функциям клеток, оба из которых имеют решающее значение для работы сконструированных тканевых имплантатов, и их следует избегать. Ограниченная работа исследовала вред цитотоксичности резазурина для пролиферации и функций клеток, а также последующее влияние на строение ткани, когда резазурин использовался для оценки жизнеспособности клеток в построении ткани. Более того, в этом исследовании мы продемонстрировали, что как цитотоксичность, так и истощение резазурина во время длительной инкубации резазурина снижают скорость восстановления резазурина или продукции резоруфина.Предыдущие исследования показали тот факт, что снижение резазурина достигало плато и не было связано с жизнеспособной концентрацией, когда достигалась высокая концентрация клеток или увеличивалось время инкубации (9–96 часов инкубации) во время непрерывной оценки жизнеспособных клеток [15, 28]. Однако стоит отметить, что анализ на основе резазурина, ранее использовавшийся другими для связи колориметрических или флуоресцентных изменений с числом жизнеспособных клеток, неявно предполагает, что скорость восстановления резазурина или продукции резоруфина не меняется в течение инкубационного периода [13].Это потенциально может привести к значительной недооценке числа клеток. Таким образом, наши данные подчеркнули важность предотвращения цитотоксичности и истощения резазурина, когда он использовался в качестве неразрушающего репортера жизнеспособности для 3D-культуры и регенеративных лекарств.

В предыдущих исследованиях сообщалось, что резазурин проникает в цитозоль жизнеспособных клеток и восстанавливается митохондриальным ферментом до резоруфина. Резоруфин может быть выведен из клеток и легко измерен с помощью колориметрического или флуорометрического считывания [13, 29, 30].На основании этих исследований мы разработали простую стратегию минимизации негативного эффекта цитотоксичности и истощения резазурина, вызванного длительным инкубационным периодом резазурина и высокой концентрацией клеток в этом исследовании. Резазурин добавляли в культуральную систему для анализа жизнеспособности и удаляли сразу после каждого измерения. Время реакции было оптимизировано, чтобы восстановление резазурина находилось в пределах линейного диапазона. Насколько нам известно, эта стратегия ранее не была задокументирована.

Наши данные показали, что резазурин и его восстановленный продукт, резоруфин, легко удаляются промыванием PBS.Добавление и удаление резазурина вместе с кратковременной инкубацией с клетками (например, 1 час в настоящем исследовании) существенно не влияли на жизнеспособность клеток. Эти результаты позволили устранить негативные эффекты цитотоксичности, истощения пула резазурина и вторичного снижения резазурина, вызванного длительной инкубацией, которые являются важными, но часто упускаемыми из виду ограничениями, препятствующими использованию резазурина в процессе инвазивного и количественного мониторинга жизнеспособности во время 3D-культуры. В предыдущих исследованиях использовалась высокая концентрация или увеличенный рабочий объем резазурина, чтобы избежать истощения резазурина и поддерживать корреляцию между числом жизнеспособных клеток и скоростью восстановления резазурина или образования резоруфина на протяжении всего анализа [20].Однако высокая концентрация резазурина свидетельствует о потенциальной цитотоксичности и нарушении функции клеток, особенно при длительной инкубации. и правильное соотношение рабочего объема клеток и резазурина для поддержания хорошей линейности между жизнеспособной клеткой и восстановлением резазурина требует оптимизации для конкретного приложения, которая требует огромного количества каркасов и драгоценных клеток.

В настоящем исследовании оценивалось влияние многократного добавления и удаления резазурина на пролиферацию и дифференцировку клеток MC 3T3E1, которые имеют решающее значение для регенерации кости.Наши данные показали сравнимые характеристики стандартной кривой и кривой роста, а также аналогичную жизнеспособность клеток характеристикам анализа МТТ, который был золотым стандартом, используемым в анализе клеточной пролиферации. Эти результаты показали, что повторное добавление и удаление резазурина не влияет на пролиферацию и жизнеспособность клеток. ALP, BSP, OCN и COL1 являются молекулами, связанными с минерализацией и маркерами остеогенной дифференцировки [31, 32]. Клетки при многократном добавлении и удалении резазурина показали снижение относительных уровней экспрессии мРНК ALP, BSP, OCN и COL1, чем в контрольной группе, хотя мы не обнаружили существенных различий между ними.Сообщалось, что резазурин способствует выработке клеточных АФК, что приводит к подавлению маркеров дифференцировки, таких как активность ЩФ, экспрессия гена COLI и минерализация остеобластных клеток [18, 33–35]. Продукция АФК запускалась сразу после добавления резазурина в клеточные культуры, тогда как митохондриальное нарушение и гибель клеток наблюдались после длительного периода инкубации [18]. Эти исследования предложили возможные причины наших данных о том, что кратковременная инкубация резазурина отрицательно влияет на дифференциальную функцию MC 3T3E1, но не влияет на пролиферацию клеток.Кроме того, исследователи предыдущего исследования обнаружили, что чувствительность клеток к резазурину варьировалась в зависимости от типа клеток и условий инкубации, таких как концентрация резазурина и время инкубации [18, 36, 37]. Таким образом, настоящее исследование подчеркнуло важность тщательного рассмотрения концентрации и времени инкубации резазурина при его использовании для измерения живых клеток и предоставило ценную стратегию для неразрушающего анализа жизнеспособности на основе резазурина в процессе 3D-культивирования.

Бутик-отели в Москве, Россия | Лучшие предложения на отдых от 2020 руб./сутки

• Мои заказы1

• • Английский

    ×

    Языки не найдены

    Попробуйте изменить поиск

  • RUB(Российский рубль)

    ×

    Валюта не найдена

    Попробуйте изменить поиск

• Поддержка
• Компания

Найдите среди 121 доступных отелей или других вариантов жилья в Москве от 50+ поставщиков.

Фильтровать по

Сортировать по

Посмотреть карту

1-100 из 121

Сортировать по: высокая популярность

• Цена: от низкой до высокой
• Цена: от высокой к низкой
• Рейтинг посетителей: от высокого к низкому
• Популярность: по возрастанию

• Ценаот низкой до высокой от высокой до низкой
• Популярность от высокой к низкой
• Рейтинг гостейот высокого до низкого

Посмотреть на карте400 м от Центра200 м от ТЦ Охотный Ряд

Этот отель расположен в районе Лефортово. К услугам гостей паровая баня, турецкая баня и массажный кабинет, а также 334 номера в классическом стиле.

От 50 606 руб. /nightSelect

Нет в наличии

Посмотреть на карте7,6 км от центра города400 м от

Гостиница, расположенная в здании индустриального стиля, расположена в самом центре Москвы и может похвастаться 1777 светлыми номерами и крытым бассейном.

От 5 960 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1000 м от центра города700 м от Кремля

Идеально расположенный в районе Лефортово, этот отель предлагает 227 комфортабельных номеров, а также солярий и джакузи.

От 14 545 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,8 км от центра города1,5 км от Большого театра

Этот изысканный отель предлагает 387 номеров плюс открытый бассейн с гидромассажной ванной, сауной и джакузи недалеко от станции метро Маяковская.

От 21 717 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2.6 км от Центра1000 м от Нового Арбата (Новый Арбат)

Расположен 2.Этот прекрасный отель расположен в 8 км от собора Василия Блаженного. К услугам гостей 293 номера, открытый бассейн и общий лаундж.

От 6 667 руб. /nightSelect

Нет в наличии

3,3 км от центра города1,0 км от Киевского вокзала

К услугам гостей крытый бассейн и ночной клуб, терраса на крыше и библиотека. Отель расположен в выставочной зоне рядом с Музеем еврейского наследия и Холокоста.

От 15 960 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1.2 км от центра города1000 м от Большого театра

К услугам гостей частный бассейн, ночной клуб, терраса на крыше и библиотека. Отель расположен в деловом районе рядом с Елисеевским магазином.

От 10 808 руб. /nightSelect

Нет в наличии

900 м от центра города700 м от ТЦ Охотный Ряд

Расположенный в районе Третьего Транспортного Кольца, недалеко от Тверской улицы, отель предлагает лобби-бар, а также очистку лица и массаж.

От 15 556 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,8 км от центра города600 м от Белорусского вокзала

Отель с 214 номерами, детскими кроватками и питанием для детей расположен в самом центре города.

От 16 566 руб. /nightSelect

Нет в наличии

900 м от центра города400 м от Большого театра

От отеля можно легко добраться до лодочного причала и универмага ГУМ. К услугам гостей паровая баня и различные виды массажа.

От 31 919 руб. /nightSelect

Нет в наличии

Гости могут отведать блюда русской кухни в ресторане a la carte отеля, всего в 5 минутах ходьбы от Музея советских игровых автоматов.

От 25 556 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2.3 км от центра города600 м от метро Новый Арбат (Новый Арбат)

Этот отель расположен в 3 км от центра Москвы. К услугам гостей собственный бассейн и круглосуточный бар.

От 5 657 руб. /nightSelect

Нет в наличии

3,0 км от центра города500 м от Белорусского вокзала

Расположен в центре, рядом с Р.Ф. Гостиная, отель предлагает звуконепроницаемые номера, а также круглосуточный бар.

От 15 859 руб. /nightSelect

Нет в наличии

5,3 км от центра города200 м от

С видом на парк Сокольники гости отеля могут насладиться солярием и джакузи, а также лобби-баром.

От 3 838 руб. /nightSelect

Нет в наличии

9,1 км от центра города400 м от

Гости этого отеля могут посетить круглосуточный ресторан или полюбоваться прекрасным видом, а сам отель находится в самом центре Москвы.

От 6 263 руб. /nightSelect

Нет в наличии

6,5 км от центра города700 м от

Предлагая детские кроватки и специальное меню для детей, а также японское меню, ресторан может похвастаться идеальным расположением рядом с автобусной остановкой.

От 17 980 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,7 км от центра города600 м от музея радио и радиолюбителей Эрнста Кренкеля

Этот приятный отель расположен в центре Москвы и может похвастаться собственным бассейном.

От 10 505 руб. /nightSelect

Нет в наличии

9,0 км от центра города300 м от

Отель занимает современное здание в Тверском районе и располагает традиционным рестораном.

От 3 131 руб. /nightSelect

Нет в наличии

3,2 км от центра города700 м от Белорусского вокзала

К услугам гостей ресторан интернациональной кухни для некурящих. Отель приветствует гостей в деловом районе Москвы.

От 3 434 руб. /nightSelect

Нет в наличии

24,7 км от центра города

В отеле есть крытый бассейн. Отель удобно расположен недалеко от дома Грибова.

От 6 869 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4,7 км от центра города1,4 км от Белорусского вокзала

366 современных номеров с детскими кроватками и детским бассейном находятся в отличном месте в районе Беговой.

От 6 667 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4,1 км от центра города1,2 км от Олимпийского спортивного комплекса

Этот отель с общим лаунджем и теннисным кортом с 2006 года находится в торговом районе.

От 9 495 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,1 км от центра города700 м от метро Красный Октябрь

Основной ресторан и 208 номеров доступны во время пребывания в привлекательном отеле, расположенном рядом с Площади Искусств.

От 4 747 руб. /nightSelect

Нет в наличии

5,8 км от центра города600 м от

Расположенный недалеко от Елисеевского магазина, этот отель может предложить крытый бассейн на территории, а также настольный теннис и бильярд в этом районе.

От 8 889 руб. /nightSelect

Нет в наличии

14,4 км от центра города1,0 км от РУДН

Круглосуточный ресторан и 1091 номер к вашим услугам на время пребывания в гостеприимной гостинице, расположенной рядом с парком Никулино.

От 4 747 руб. /nightSelect

Нет в наличии

3,0 км от центра города1,7 км от: Музей радио и радиолюбителей Эрнста Кренкеля

Отель предлагает доступ к станции метро Павелецкая, расположенной в 300 метрах, а на территории отеля вы сможете насладиться бассейном и незабываемым видом.

От 11 111 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4,4 км от центра города1,1 км от Белорусского вокзала

К услугам гостей лаунж-ресторан и 106 номеров на время пребывания в гранд-отеле, расположенном рядом с Пушкинской площадью.

От 11 818 руб. /nightSelect

Нет в наличии

9,1 км от центра города400 м от

блюда европейской кухни подаются гостям этого уютного отеля, идеально расположенного в самом центре Москвы.

От 2 020 руб. /nightSelect

Нет в наличии

3,5 км от центра города400 м от Киевского вокзала

Отель на 427 номеров с крытым бассейном с подогревом и восхитительным видом на реку находится недалеко от Музея Москвы и имеет хорошее транспортное сообщение со станцией метро поблизости.

От 5 152 руб. /nightSelect

Нет в наличии

3.8 км от центра города1,4 км от Киевского вокзала

Этот отель в торговом районе предлагает гостям бассейн и круглосуточный ресторан.

От 16 566 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,8 км от центра города300 м от Олимпийского спортивного комплекса

Отель с частным бассейном находится примерно в 30 минутах ходьбы от центра Москвы.

От 2 828 руб. /nightSelect

Нет в наличии

Этот исторический отель расположен в самом центре Москвы, недалеко от Красной площади.

От 10 404 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,9 км от центра города700 м от метро Красный Октябрь

Отель с потрясающим видом на реку приглашает гостей в лобби-ресторан, где подают фирменные блюда аутентичной кухни.

От 4 848 руб. /nightSelect

Нет в наличии

5,8 км от центра города400 м от

Этот отель расположен в районе Аэропорт, рядом с Елисеевским магазином. К услугам гостей оздоровительный клуб, солярий и джакузи.

От 15 051 руб. /nightSelect

Нет в наличии

11,9 км от центра города800 м от

Этот приятный отель расположен в центре района Сокол и предлагает великолепный вид, а также оздоровительный клуб, финскую сауну и солярий.

От 5 354 руб. /nightSelect

Нет в наличии

700 м от центра города500 м от ТЦ Охотный Ряд

В стоимость входит доступ к частному бассейну и круглосуточному бару, расположенному рядом с Соборной площадью и станцией метро «Охотный ряд».

От 13 636 руб. /nightSelect

Нет в наличии

3,3 км от центра города2,0 км от Музей радио и радиолюбителей Эрнста Кренкеля

К услугам гостей открытый бассейн и русское меню, а также расположение на берегу реки в торговом районе.

От 11 414 руб. /nightSelect

Нет в наличии

10,0 км от центра города600 м от

Удобно расположенный в районе Марфино ресторан предлагает блюда европейской кухни и бассейн.

От 8 788 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4,7 км от центра города700 м от

Этот изысканный отель, расположенный в центре Москвы, предлагает 236 номеров с ванными комнатами и частным бассейном с сауной.

От 3 636 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4,5 км от центра города1,5 км от центра искусств Винзавод

Этот эффектный отель расположен в Тверском районе. К услугам гостей современные номера и традиционный ресторан.

От 5 657 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,6 км от Центра города1,1 км от Нового Арбата (Новый Арбат)

С 1904 года отель принимает гостей в районе Третьего транспортного кольца, предлагая 32 уютных номера и кафе-бар.

От 11 616 руб. /nightSelect

Нет в наличии

600 м от центра города200 м от Большого театра

Расположенный в центре, рядом с Музеем чая, отель предлагает номера для некурящих, а также кафе-бар.

От 13 838 руб. /nightSelect

Нет в наличии

8,1 км от центра города800 м от

Расположенный недалеко от Шуховской башни, этот отель состоит из 560 номеров с ванными комнатами.

От 5 152 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,3 км от центра города600 м от метро Чистые пруды

Гости будут впечатлены исключительным видом на город и близостью к бару Open Moscow и Олимпийскому стадиону.

От 14 444 руб. /nightSelect

Нет в наличии

15,5 км от центра города600 м от

Этот 12-этажный отель расположен в здании с европейской архитектурой, недалеко от историко-архитектурного музея под открытым небом «Царицыно».

От 7 172 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4,5 км от центра города1,7 км от Олимпийского спортивного комплекса

Отель с открытым бассейном и лобби-рестораном идеально расположен в районе Хамовники.

От 13 636 руб. /nightSelect

Нет в наличии

13,8 км от центра города900 м от

Этот отель, расположенный рядом с Храмом Знамения Божией Матери, предлагает уникальное расположение и может похвастаться 201 современным номером, а также бассейном.

От 3 636 руб. /nightSelect

Нет в наличии

6,2 км от центра города500 м от

Недалеко находится Шуховская башня, а также станция метро «Автозаводская» в 950 метрах от отеля.

От 6 061 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,2 км от центра города1000 м от метро Красный Октябрь

В отеле есть доступ к Музею сладостей. К услугам гостей частный бассейн и поле для гольфа, а также номера для некурящих.

От 12 222 руб. /nightSelect

Нет в наличии

7,7 км от центра города700 м от станции МЦК Хорошёво

Расположенный в районе Хорошево-Мневники отель может похвастаться круглосуточным баром и прекрасным видом на город.

От 9 899 руб. /nightSelect

Нет в наличии

13,4 км от центра города500 м от метро Российский университет дружбы народов

Уютный отель в оживленном районе с 510 номерами и бассейном, предлагает детские кроватки, питание и детский клуб для гостей с детьми.

От 6 465 руб. /nightSelect

Нет в наличии

5,8 км от центра города200 м от

Отель с частным бассейном и лаунж-рестораном расположен в центре района Третьего транспортного кольца.

От 8 586 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,3 км от центра города600 м от метро Чистые пруды

Этот отель предлагает номера с видом на город, а удобное расположение обеспечивает легкий доступ к Мавзолею Ленина.

От 12 626 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,4 км от центра города1000 м от метро Чистые пруды

Предлагая 40 номеров с видом на город, отель расположен в Красносельском районе, в нескольких шагах от Большого театра.

От 2 727 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,1 км от центра города800 м от Гостиного двора Аркады

Расположенный в нескольких шагах от Мавзолея Ленина, отель предлагает 15 номеров с видом на город.

От 87 576 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,1 км от центра города1,4 км от метро Новый Арбат (Новый Арбат)

Этот современный отель на 29 звукоизолированных номеров расположен в центре Москвы.

От 15 455 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,3 км от центра города700 м от метро Чистые пруды

Отель бизнес-класса расположен недалеко от Красной площади, в районе Садовое кольцо.

От 15 960 руб. /nightSelect

Нет в наличии

800 м от центра города300 м от Большого театра

Этот бутик-отель с видом на город находится недалеко от достопримечательностей Москвы, включая улицу Кузнецкий Мост.

От 6 061 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,4 км от центра города800 м от метро Красный Октябрь

От отеля легко добраться до Музея изобразительных искусств имени А. С. Пушкина с 14 номерами в самом центре Москвы.

От 13 434 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,4 км от центра города500 м от метро Чистые пруды

Этот бутик-отель расположен рядом с Московской хоральной синагогой и собором Василия Блаженного. К услугам гостей 25 звуконепроницаемых номеров.

От 15 556 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,3 км от центра города600 м от метро Новый Арбат (Новый Арбат)

Исторический отель является хорошей отправной точкой для знакомства с достопримечательностями Москвы, включая Музей Москвы и Мемориальную доску А.В. Ляпидевский.

От 10 505 руб. /nightSelect

Нет в наличии

20,3 км от центра города

Доступ к храму и часовне св.Серафима Саровского на Покровском кладбище, в отеле есть летняя терраса и общий лаундж, где гостям предлагаются современные номера.

От 6 869 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,4 км от центра города600 м от музея радио и радиолюбителей Эрнста Кренкеля

Расположенный в нескольких шагах от ГУМа, отель предлагает 25 номеров с видом на город.

От 6 768 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1.5 км от центра города400 м от метро Чистые пруды

Предлагая 21 номер с видом на город, отель расположен в районе Садового кольца, всего в нескольких шагах от Мавзолея Ленина.

От 11 515 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4,5 км от центра города300 м от

С 2010 года отель ждет гостей в Тверском районе, предлагая 33 комфортабельных номера и кафе-бар.

От 7 576 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1.5 км от центра города1,1 км от Большого театра

Этот отель находится всего в 1,3 км от Большого театра и располагает рестораном с обслуживанием по меню, телевизором с плоским экраном и кабельными каналами, а также баром.

От 5 051 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,8 км от центра города1,5 км от Большого театра

Исторический отель расположен в оживленном районе, недалеко от Государственного исторического музея.

От 8 586 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1.8 км от центра города1,5 км от Большого театра

Этот бутик-отель с видом на город находится недалеко от достопримечательностей Москвы, включая Красную площадь.

От 9 899 руб. /nightSelect

Нет в наличии

800 м от центра города400 м от Большого театра

Этот бизнес-отель находится рядом с Большим театром и улицей Кузнецкий мост. К услугам гостей 42 звукоизолированных номера.

От 8 687 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2.6 км от центра города700 м от Олимпийского спортивного комплекса

Неподалеку находится Московская Соборная мечеть, а также станция метро «Проспект Мира» в 250 метрах от отеля.

От 3 333 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,1 км от центра города800 м от Гостиного двора Аркады

Этот отель расположен в 15 минутах ходьбы от центра Москвы и менее чем в 15 минутах ходьбы от Мавзолея Ленина. К услугам гостей телевизор с плоским экраном и кабельными каналами.

От 9 293 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4,5 км от центра города600 м от

Этот бутик-отель расположен недалеко от Московской хоральной синагоги. К услугам гостей континентальный завтрак.

От 12 121 руб. /nightSelect

Нет в наличии

8,2 км от центра города2,5 км от станции МЦК Шелепиха

Отель расположен в нескольких шагах от парка Красная Пресня. В отеле 89 номеров с видом на сад.

От 13 535 руб. /nightSelect

Нет в наличии

7,7 км от центра города800 м от

Гости будут впечатлены панорамным видом на горы и близостью к Деточке и арене ЦСКА.

От 13 434 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,4 км от центра города1,1 км от Большого театра

Расположенный недалеко от Площади Искусств в самом центре Москвы, этот отель предлагает 7 номеров.

От 6 162 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,2 км от центра города800 м от метро Новый Арбат (Новый Арбат)

Неподалеку находится Московский сад Эрмитаж, а также станция метро «Смоленская» в 220 метрах от отеля.

От 5 354 руб. /nightSelect

Нет в наличии

13,1 км от центра города

В отеле вы найдете восхитительный лаунж-ресторан, который предлагает избранные типичные блюда русской кухни.

От 7 475 руб. /nightSelect

Нет в наличии

11,9 км от центра города1000 м от

Предлагая удобное расположение рядом с Храмом Покрова Пресвятой Богородицы, отель также находится недалеко от Часовни Св. Космы и Дамиана.

От 5 051 руб. /nightSelect

Нет в наличии

8,8 км от центра города

Хостел расположен в 0,8 км от озера, в непосредственной близости от Кремлевских стен и башен.

От 2 424 руб. /nightSelect

Нет в наличии

Самый большой вариант:

6 взрослых

2 спальни

3 кровати

2,9 км от центра города1,6 км от станции Красный Октябрь

Апартаменты с кухней находятся всего в 2.9 км от Красной площади.

От 7 475 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,1 км от центра города900 м от Большого театра

Этот исторический отель находится рядом с Пушкинской площадью и ГУМом. К услугам гостей 7 звуконепроницаемых номеров.

От 4 242 руб. /nightSelect

Нет в наличии

9,9 км от центра города600 м от

Гостиница состоит из 96 номеров и включает в себя массажный кабинет, парную и солярий. Отличительной особенностью является расположение в самом центре Москвы.

От 9 091 руб. /nightSelect

Нет в наличии

6 взрослых

2 спальни

3 кровати

1.1 км от центра города900 м от Большого театра

Трехкомнатная квартира с полностью оборудованной кухней расположена в 20 минутах ходьбы от центра Москвы.

От 8 687 руб. /nightSelect

Нет в наличии

Самый большой вариант:

2 взрослых

1 спальня

3 кровати

1,1 км от центра города900 м от Большого театра

Отель удобно расположен рядом с Большим театром, а также Государственным историческим музеем.

От 3 737 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2,2 км от центра города1,3 км от метро Чистые пруды

Расположенный недалеко от Кремля в центре Москвы, этот отель предлагает 20 номеров.

От 2 222 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4,7 км от центра города500 м от

Рядом с отелем есть станция метро, ​​и гости могут легко добраться до Измайловского парка, который находится недалеко.

От 4 040 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4,1 км от центра города600 м от

Этот бутик-отель с видом на море находится недалеко от достопримечательностей Москвы, включая Соборную площадь.

От 8 384 руб. /nightSelect

Нет в наличии

Самый большой вариант:

9 взрослых

3 спальни

4 кровати

3.1 км от центра города300 м от

Расположенный в 300 метрах от станции метро Павелецкая, дом состоит из кухни и 1 санузла.

От 11 313 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4 взрослых

1 спальня

2 кровати

1,1 км от центра города900 м от Большого театра

Расположенные в Басманном районе, в 15 минутах ходьбы от Мавзолея Ленина, апартаменты площадью 45 м² подходят для проживания до 4 человек.

От 7 374 руб. /nightSelect

Нет в наличии

11,0 км от центра города800 м от

Этот бутик-отель является хорошей отправной точкой для знакомства с достопримечательностями Москвы, включая Беляевскую галерею и Спасо-Преображенскую церковь в Старом Беляево.

От 6 667 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,9 км от центра города1,3 км от метро Чистые пруды

Этот отель находится недалеко от сада Эрмитаж и состоит из 6 номеров с отдельными ванными комнатами.

От 6 970 руб. /nightSelect

Нет в наличии

11,3 км от центра города1000 м от метро Живописный мост

В этом отеле в европейском стиле подают блюда русской кухни, приготовленные в ресторане в саду на территории отеля.

От 10 808 руб. /nightSelect

Нет в наличии

2 взрослых

1 спальня

1 кровать

4,2 км от центра города800 м от Киевского вокзала

Этот дом с 1 спальней, гидромассажной ванной и сауной расположен недалеко от Парка-музея Горького и 2.8 км от улицы Арбат.

От 10 303 руб. /nightSelect

Нет в наличии

12,3 км от центра города400 м от

Каждый гость сможет насладиться вкусными блюдами русской кухни в круглосуточном ресторане отеля.

От 3 737 руб. /nightSelect

Нет в наличии

1,8 км от центра города1,6 км от метро Новый Арбат (Новый Арбат)

Расположенный недалеко от Красной площади, отель предлагает ресторан для гурманов, где подают блюда европейской кухни.

От 36 970 руб. /nightSelect

Нет в наличии

Самый большой вариант:

4 взрослых

1 спальня

2 кровати

3,4 км от центра города100 м от Белорусского вокзала

Остановившись в этой высококачественной квартире в историческом центре Москвы, гости смогут быстро добраться до Московского Кремля.

От 7 172 руб. /nightSelect

Нет в наличии

Самый большой вариант:

6 взрослых

2 спальни

3 кровати

1.6 км от центра города200 м от Нового Арбата (Новый Арбат)

Апартаменты с мини-кухней с чайником, варочной панелью и стиральной машиной находятся в 20 минутах ходьбы от центра Москвы.

От 8 283 руб. /nightSelect

Нет в наличии

Самый большой вариант:

4 взрослых

1 спальня

2 кровати

2,8 км от центра города1,3 км от станции Красный Октябрь

Отель расположен в Даниловском районе Москвы, примерно в 30 км от аэропорта Внуково.

От 6 667 руб. /nightSelect

Нет в наличии

4 взрослых